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1、模板DNA；

2、引物；

3、四種脫氧核糖核苷酸；

4、DNA聚合酶；

5、反應(yīng)緩沖液、Mg2+等。

2、退火(annealling)：當(dāng)溫度降低時(shí),引物與模板DNA中互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合成雜交分子,低溫下,引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（55℃,30s）。

3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPS、 Mg2+存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出與模板DNA鏈互補(bǔ)的DNA子鏈,中溫延伸,DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（70～72℃,30～60s）

一、無(wú)Mg2+buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值,使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度,但不能超過(guò)50?mmol/L,否則會(huì)抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:終濃度為1.5～2.0mmol/L,其對(duì)應(yīng)dNTP為200?μmol/L,注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系,由于dNTP與Taq酶竟?fàn)嶮g2+,當(dāng)dNTP濃度達(dá)到1?mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。、

三、BSA：一般用乙酰化的BSA,起著減少PCR管對(duì)Taq酶的吸附作用,對(duì)Taq酶有保護(hù)作用。

四、底物（dNTPs）：dNTPs具有較強(qiáng)酸性,其儲(chǔ)存液用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.5,一般存儲(chǔ)濃度為 10 mmol/L,各成份以等當(dāng)量配制,反應(yīng)終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應(yīng),但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性,而反應(yīng)速度會(huì)降低。

五、Taq酶：能耐95℃高溫而不失活,其最適pH值為8.3～8.5,最適溫度為75～80℃,一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板,以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ),按5’→3’方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3’端,合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。無(wú)3’→5’的外切酶活性,沒(méi)有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過(guò)高,會(huì)增加其錯(cuò)配率。用量一般為0.5～5個(gè)單位/100μl。

六、模板：PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高,但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在,如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高,否則擴(kuò)增可能不會(huì)成功,在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。

七、引物：引物濃度一般為0.1～0.5μmol/L,濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增,濃度過(guò)低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過(guò)低。引物長(zhǎng)度一般15～30個(gè)堿基,引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對(duì),末位堿基最好選用A、C、G（因T錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸）。

引物G+C約占45～55%,堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布,避免嘧啶或嘌呤堆積,兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在,不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。

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數(shù)字PCR儀溫度校準(zhǔn)儀

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PCR儀熒光校準(zhǔn)儀

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