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肽(peptide)是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物,它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。

一般肽中含有的氨基酸的數(shù)目為二到九,根據(jù)肽中氨基酸的數(shù)量的不同,肽有多種不同的稱呼:由兩個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽,同理類推還有三肽、四肽、五肽等,一直到九肽。通常由10~100氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫多肽,它們的分子量低于10,000Da(Dalton,道爾頓),能透過半透膜,不被三氯乙酸及硫酸銨所沉淀。也有文獻把由2~10個氨基酸組成的肽稱為寡肽(小分子肽);10~50個氨基酸組成的肽稱為多肽;由50個以上的氨基酸組成的肽就稱為蛋白質(zhì),換言之,蛋白質(zhì)有時也被稱為多肽。多肽也簡稱為肽,是20世紀被發(fā)現(xiàn)的。

細胞因子模擬肽

利用已知細胞因子的受體從肽庫內(nèi)篩選細胞因子模擬肽,近年成為國內(nèi)外研究的熱點。國外已篩選到了人促紅細胞生成素,人促血小板生成素,人生長激素、人神經(jīng)生長因子及白細胞介素等多種生長因子的模擬肽,這些模擬肽的氨基酸序列與其相應的細胞因子的氨基酸序列不同,但具有細胞因子的活性,并且具有分子量小的優(yōu)點。這些細胞因子模擬肽正處于臨床前或臨床研究階段。

抗菌性活性肽

當昆蟲受到外界環(huán)境刺激時產(chǎn)生大量的具有抗菌活性的陽離子多肽,已篩選出百余種抗菌肽,體內(nèi)外實驗證實,多個抗菌肽不僅有很強的殺菌能力還能殺死腫瘤細胞。例如,從蠶體內(nèi)篩選的抗菌肽D表現(xiàn)了很好的應用前景,并能利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)。蛇毒內(nèi)也存在多種活性多肽,從蛇毒內(nèi)分離出一個13個氨基酸(INKAIAALAKKLL)小肽,其對G+及G-菌均有極強的殺菌能力。

用于心血管疾病的多肽

很多植物中藥有降血壓、降血脂、溶血栓等作用,不僅可用作藥物,亦可用作保健食品。但由于其作用成份不能確定。其應用受到很大限制�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多有效成分是小分子多肽,比如我國科學家從大豆內(nèi)加工分離出的活性多肽,可通過小腸直接吸收,能防治血栓,高血壓和高血脂,還能延緩變老,提高肌體抗腫瘤力。從人參、茶葉、銀杏葉等植物內(nèi)也分離出很多用于心血管疾病的小肽。

其它藥用小肽

小肽藥物除在上述幾大方面已取得較大進展外,在其它很多領(lǐng)域也取得一些進展。比如stiernberg等發(fā)現(xiàn)一個合成肽(TP508)肽能促進傷口血管的再生,加速皮膚深度傷口的愈合。Pfister等發(fā)現(xiàn)一個小肽(RTR)4能防止堿損傷角膜內(nèi)炎癥細胞的侵潤,抑制炎癥反應。Carron等證實其篩選的2個合成肽能抑制破骨細胞對骨質(zhì)的重吸收。

診斷用多肽

多肽在診斷試劑中最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細胞、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體,多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強,且易于制備,因此裝配的檢測試劑,其檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低,易于臨床應用�，F(xiàn)在用多肽抗原裝配的抗體檢測試劑包括:甲、乙、丙、庚或肝病毒、艾滋病病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒、風疹病毒、梅毒螺旋體、囊蟲、錐蟲、萊姆病及類風濕等。使用的多肽抗原大部分是從相應致病體的天然蛋白內(nèi)分析篩選獲得,有些是從肽庫內(nèi)篩選的全新小肽。

免疫活性肽、神經(jīng)活性肽、其他活性肽等。

其他活性肽包括:膽固醇肽、促進礦物質(zhì)吸收的肽(CppS)、酶調(diào)節(jié)劑(如促胰酶肽)、激素肽如生長激素釋放因子(GRFS)、白蛋白胰島素增效肽、抗菌多肽(如乳酸鏈球菌素、橡膠素)、抗癌多肽(如腫瘤細胞壞死因子、環(huán)已肽)、抗艾滋病肽(如GLQ蛋白)等。

生物提取的多肽具有很強的活性,所以叫做活性肽!只有活性的肽才能對人體產(chǎn)生很好的效果!但是人工合成的多肽有很多是沒有活性的,是需要篩選的,只有活性肽才能被人體安全使用!

活性肽主要控制人體的生長、發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和新陳代謝,它在人體處于一種平衡狀態(tài),若活性肽減少后,人體的機能發(fā)生重要變化,對于兒童來說,他的生長、發(fā)育變得緩慢,甚至停止,長久下去就形成了侏儒,對成年人或老年人,缺少活性肽后,自身的免疫力就會下降,新陳代謝紊亂,內(nèi)分泌失調(diào),引起各種疾病的產(chǎn)生,如失眠、身體消瘦或浮腫。由于活性肽還作用于神經(jīng)系統(tǒng),因此人體就會變得動作遲緩,頭腦不再聰慧,更主要的是活性肽減少,直接引起人身體各部位逐漸出現(xiàn)全面衰老,引發(fā)各種疾病。

在不同的年齡時期,各種活性肽的分泌量也有很大差別,按分泌量劃分,人的一生一般可分為:

1、分泌充足期(25歲以前的青年期)這個時期內(nèi)分泌量均衡、免疫功能強勁,人體一般不易出現(xiàn)疾病;

2、分泌不足期(失衡期)(30-50歲壯年和中年期)這一時期如果活性肽分泌不足或失衡會出現(xiàn)各種相關(guān)的亞健康狀態(tài)和輕微疾病癥狀(40歲以上的人群常見);

3、分泌匱乏期(嚴重不足期)(50歲以上中年和老年期)這一時期嚴重如果活性肽嚴重不足和嚴重失衡,可能出現(xiàn)非常突出的衰老癥狀,或會引起各種相關(guān)疾病發(fā)生(50歲以上人群比較明顯);

4、分泌終止期(衰老期),這一時期很短,由于控制人體內(nèi)分泌的"司令官"活性肽不分泌或分泌減少,從而導致細胞功能衰退,引發(fā)器官功能衰竭和喪失,最后導致生命終結(jié)。多肽由多個分子α-氨基酸的-NH2與-COOH互相縮合失水后形成10個肽鍵(-CONH-)以上的長鏈化合物。它包括多種在人的機體中具一定生理活性的化合物,可以從動物組織中提取,也可能人工合成。蛋白質(zhì)即是以各種氨基酸按一定順序以肽鍵形成的長鏈肽,通過多種次級鍵交聯(lián)結(jié)合而成的高分子化合物,蛋白質(zhì)具有復雜的四級結(jié)構(gòu),通過不同程度的水解,破析結(jié)構(gòu)可得包括多肽等的產(chǎn)物:蛋白質(zhì)→蛋白脈(proteose) →蛋白胨(peptone) →多肽→寡肽(oligopeptide,2~10個肽鍵的長鏈肽) →氨基酸。這同時也表明了蛋白質(zhì)的合成途徑。因此,借人工合成多肽,不僅可用于生化制藥工業(yè),還可用來研究闡明蛋白質(zhì)的合成途徑及其結(jié)構(gòu)。

人體很多活性物質(zhì)都是以肽的形式存在的。肽涉及人體的激素、神經(jīng)、細胞生長和生殖各領(lǐng)域,其重要性在于調(diào)節(jié)體內(nèi)各個系統(tǒng)和細胞的生理功能,激活體內(nèi)有關(guān)酶系,促進中間代謝膜的通透性,或通過控制DNA轉(zhuǎn)錄或影響特異的蛋白合成,最終產(chǎn)生特定的生理效應。肽是涉及人體內(nèi)多種細胞功能的重要物質(zhì)。肽可以合成細胞,并調(diào)節(jié)細胞的功能活動。肽在人體作為神經(jīng)遞質(zhì),傳遞信息。肽可在人體作為運輸工具,將人體所食的各種營養(yǎng)物質(zhì)與各種維生素、生物素、鈣及對人體有益的微量元素輸送到人體各細胞、器官和組織。肽是人體重要的生理調(diào)節(jié)物,它可全面調(diào)節(jié)人體生理功能,增強和發(fā)揮人體生理活性,它具有重要的生物學功能。肽對人的細胞活性、功能活動、生命存在太重要了。但現(xiàn)代人因各種因素使人體中的肽流失、損失,合成肽的能力大大減弱,因此現(xiàn)代人體缺乏肽,必須補充人工合成肽,補肽就是補活性,補肽就是補活力,補肽就是補生命。(摘自 酶法多肽專家鄒遠東教授 《酶法多肽論》)

多肽類保健食品只需置于陰涼干燥處即可。

對于多肽試劑和多肽類藥物則需要保存在干燥器中。在將它們暴露于空氣之前, 冷凍干燥多肽可以放于室溫。這將是濕度影響減少,當無法冷凍干燥時,最好的方法是以小的工作樣量存放。對于含Cys, Met orTrP的多肽試劑,脫氧緩沖劑對其溶解必不可少,因為這種多肽試劑易被空氣氧化,在封瓶前,慢慢流過多肽試劑的氮氣或氬氣也會降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽試劑也容易降解,所有這些肽與不含這些有問題解苷的那些肽相比,生命期有限。

多肽具廣泛的溶解性。多肽不溶的主要問題是形成二級結(jié)構(gòu)。除了最太肽外,這點都會發(fā)生, 在有多重疏水殘基的肽中更顯著。鹽會促進二級結(jié)構(gòu)形成。我們建議先在無菌蒸餾水或去離子中溶解多肽。如需要增加溶解率, 可用聲處理。溶解仍有問題, 加少量稀乙酸(10%)或氨水,會便于溶解。

要長期保存多肽試劑, 最好冷凍干燥,冷干粉可在-20℃或更低存放幾年而很少或無降解。溶液中的多肽遠不穩(wěn)定。 多肽易受細菌降解,應用無菌純化水溶解。

含有Met,Cys或Tyr殘基的多肽溶液由于氧化,壽命有限。應溶于無氧溶劑, 為防止重復凍融的破壞, 建議溶解過量的肽的便實驗,其余多肽以固體形成保存。

大多數(shù)肽的首選溶劑是超純抽氣水。稀乙酸或氨水分別對于堿性或酸性多肽的溶解很重要。這些方法不溶的多肽, 需要DMF、脲、guanidiniam chloride或acetonitrnle來溶解,這些溶劑可能某些實驗有副作用。所以我們建議設計多肽時要加注意。

殘基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val將全增加多肽的溶解難度。

發(fā)展歷程

隨著科技的發(fā)展,生產(chǎn)肽的方法也在不斷發(fā)展。五六十年代,主要是從動物臟器獲取肽。如胸腺肽,其生產(chǎn)方法是將剛生下來的小牛宰殺之后,割下其胸腺,然后用震蕩分離的生物技術(shù),將小牛胸腺中的肽震蕩分離出來,制成胸腺肽針劑。這種胸腺肽主要用于人體免疫�，F(xiàn)如今,這種肽已處于淘汰狀態(tài)。世界上曾經(jīng)一度流行的"瘋牛病",這種病毒主要吞噬動物大腦中的蛋白質(zhì),破壞其腦組織、細胞及神經(jīng)。人體一旦染上此病毒,比患上癌癥還可怕,最終成為"植物人"或很快死亡。還有從人體血液中提煉出來的肽 ,其副作用也很大,它不僅容易使人體染上甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、艾滋病毒、性病病毒,而且有排異過敏反應,這種反應一旦出現(xiàn),生命就危在旦夕。

幾種方法

固相合成法、液相合成法

用這種方法生產(chǎn)肽的企業(yè)在美國硅谷就有一家。他們主要是購買世界上一些精細化工廠生產(chǎn)的氨基酸為原料定向合成某種單肽,屬醫(yī)藥原料中間體,主要用于西藥配方,以增強藥效、增強人體對藥的吸收速度和吸收率。

酸解法或堿解法

這種肽主要出現(xiàn)在日本。用酸解法生產(chǎn)的"大豆多肽",屬"食品添加劑",主要用于老人和兒童食品,其目的是增強這兩種人群對食品營養(yǎng)的吸收。世界上擁有"大豆多肽"的國家只有日本和中國。但其所用的原料、水解法和產(chǎn)品性質(zhì)大有不同。日本所用原料是豆粕,水解方法是酸法,生產(chǎn)的肽酸性化學物質(zhì)難以除盡,而且有苦味,需用活性炭吸附、脫苦,而活性炭免不了會侵入肽體。

酶法生產(chǎn)的生物活性肽

酶法生產(chǎn)的生物活性肽。這種肽主要產(chǎn)在中國,代表著當今世界肽研究、開發(fā)、生產(chǎn)、創(chuàng)新的水平和潮流。酶法生產(chǎn)的生物活性肽是用人體所需要的食品級植物蛋白酶,將人體平常所食的食物蛋白質(zhì)酶解成小分子活性多肽。它具有極強的生物活性和多樣性,已在世界范圍內(nèi)引起關(guān)注,成為當今世界追崇的熱點。如武漢九生堂生產(chǎn)的"大豆多肽",所用原料是含量在90%以上的大豆分離蛋白,水解方法是酶法,所用的酶屬食品級植物蛋白酶。生產(chǎn)的"大豆多肽"無苦味,且風味芳香宜人,對人體無任何毒副作用。產(chǎn)品屬終端產(chǎn)品,被中國創(chuàng)新基金列為無償資助項目,已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),其終端產(chǎn)品"大豆多肽"口服液是世界上第一個用酶法生產(chǎn)的大豆多肽終端產(chǎn)品,在第89屆廣交會上受到世界客商的青睞。

具體合成由下列幾個循環(huán)組成:

除去保護

Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去 除氨基的保護基團。

激活和交聯(lián)

下一個氨基酸的羧基被一種激活劑所激活�；瘜W工藝常用HBTU/HCTU/HITU/HATU+NMM/DIPEA或HOBT+DIC作激活劑,激活的單體 與游離的氨基反應交聯(lián),形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反 應完成。循環(huán):這兩步反應反復循環(huán)直到合成完成。 氨基酸縮合結(jié)束后,可用適量TFA進行洗脫,根據(jù)起酸堿性,可選擇10%TFA/DCM溶液,至100%TFA,以此類推。(注:此種方法為個人合成經(jīng)驗,并無文獻資料可查;可根據(jù)需要進行參考。知識有限,望謹慎參考)

HPLC分析純化

分析HPLC使用柱子和泵系統(tǒng),可以經(jīng)受傳遞高壓,這樣可以用極細的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在幾分鐘內(nèi)高度被分析。

HPLC分兩類:離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷。 分離是一種電荷相互作用,通過可變PH, 離子強度, 或兩者洗脫出多肽,通常, 先用低離子強度的溶液,以后逐漸加強或一步一步加強,直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。

反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上,用降低離子強度洗脫, 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構(gòu)成,這種鏈長度為G4-G8碳原子。 由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的, 高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而,總體實踐中, 這兩類柱互變無多少顯著差別,別類載體由碳水化合物構(gòu)成, 比如苯基。

典型的操作常由兩綬沖劑組成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA——H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱,那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m)

大量各種緩沖劑含許多不同試劑,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸, 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨,TFA/TEA,磷酸鈉或鉀,異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑,但要注意一點:硅反相柱料不能長時間暴露于高pH,甚至微堿pH, 因為這樣會破壞柱子。

不要把肽含量和純度搞混了。肽的純度可能是100%, 而肽含量相關(guān)帶電基團(如Arg, Lys )的抗離子量和肽親水性決定。這是合成肽的本身特性。

酶法多肽是以蛋白酶降解蛋白質(zhì)獲得的多肽。

以蛋白酶對卵蛋白、乳蛋白、酪蛋白、魚蛋白、昆豆蛋白等動物蛋白降解獲得的多肽豆有促進、增強、調(diào)節(jié)免疫的生理功能。此類酶法多肽服食進入循環(huán)系統(tǒng)和人體組織后,能刺激機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生特異性免疫反應。

多肽進入人體后,可作為抗原,不需要T細胞的輔助就能直接刺激B細胞產(chǎn)生抗體。但多肽進入人體后,可誘導和促進T細胞分化、成熟;刺激B細胞產(chǎn)生并分泌免疫球蛋白(抗體)參與人體免疫反應;提高自然殺傷細胞(NK)活力,在無抗體參與的情況下,殺傷腫瘤細胞,發(fā)揮廣譜抗腫瘤、抗感染作用,參與免疫調(diào)節(jié);刺激K細胞殺傷不易被吞噬的病原體,如寄生蟲、惡性腫瘤細胞等;刺激N細胞的殺傷能力;刺激吞噬細胞的吞噬能力,主要提高其吞噬消化功能、分泌功能,參與免疫應答、免疫調(diào)節(jié)過程,并抗感染、抗腫瘤;增強紅細胞免疫功能;提高白細胞介素-2(1L-2)的產(chǎn)生水平和受體表達水平;增強外周單核細胞Y-干擾素的產(chǎn)生;增強血清中SOD活性;可顯著增加淋巴細胞功能;能有效防止輻射核放化療及空氣、水、食物、環(huán)境污染中毒豆白細胞的減少;能有效抑制腫瘤細胞的生長;可防止惡性腫瘤放化療引起的CD4+降低。總之,酶法多肽是可食免疫劑,可全面增強人體免疫功能和免疫調(diào)節(jié),是一種現(xiàn)代新型免疫劑,是現(xiàn)代免疫的珍品。

起源

用生物酶催化蛋白質(zhì)的方法稱為酶法,用生物酶催化的方法催化蛋白質(zhì)獲得的多肽叫做"酶法多肽"。

酶法多肽一詞最早起源于1996年,多肽科學家鄒遠東用生物酶催化蛋白質(zhì)獲得多肽取得了巨大成功。當年,人民日報海外版對外報道這一消息,引起了世界關(guān)注,之后得14年內(nèi),中國中央主流媒體相繼將鄒遠東作為中國自主創(chuàng)新的重大典型予以報道,2006年《光明日報》以《鄒遠東與他創(chuàng)立的酶法多肽》為題,連續(xù)三天進行了專題連續(xù)報道;《科技日報》以《鄒遠東自主創(chuàng)新酶法多肽》為題用整版8000字的篇幅報道了鄒遠東;新華社新華網(wǎng)、《人民日報》人民網(wǎng)、中央電視臺央視網(wǎng)、中央人民廣播電臺中國廣播網(wǎng)、《解放軍報》中國軍網(wǎng)、中國科學院網(wǎng)、中國疾病控制中心網(wǎng)、《中國醫(yī)藥報》、《中國知識產(chǎn)權(quán)報》均在突出位子重點報道了鄒遠東自主創(chuàng)新酶法多肽的事跡。酶法多肽為此而叫響、為此而成名。

特點

傳統(tǒng)獲得肽的方法有很多。傳統(tǒng)法主要有:酸法、堿法、電法、人工嫁接法、基因表達法等。但在工藝技術(shù)方面,這些合成工藝方法的局限性,是導致其這些合成方法沒有產(chǎn)品的原因。

而酶法在傳統(tǒng)法的基礎上有所突破和創(chuàng)新,適應了低碳經(jīng)濟和綠色環(huán)保的要求。酶法就是用生物酶催化蛋白質(zhì)獲得多肽,就是蛋白質(zhì)降解,人工合成的多肽。酶法較酸法、堿法、電法溫和、環(huán)保。生產(chǎn)工藝簡易,投資少、見效快,適宜工業(yè)化生產(chǎn),其代表產(chǎn)品有三九蛋白肽、九生牌苦瓜多肽等。

酶法獲得多肽,分子量易控制、產(chǎn)品自身富有綠色屬性、生產(chǎn)出來的肽無苦味、肽分子量小(分子量大都在1000以下)、這些小分子肽不需消化直接吸收,具有動力、載體、運輸、遞質(zhì)和營養(yǎng)功能,特別是它具有極強的活性和多樣性即重要的生物學功能。